Kraków, Małopolska czesc@enolab.pl PIOTR 506 519 639     📆 Poniedziałek–Piątek    🕙 10:00–14:00

Ciemna strona FJM

Wszyscy zdajemy sobie sprawę z doniosłości roli jaką, w naszym nie najcieplejszym klimacie, pełnią bakterie kwasu mlekowego (BKM, ang. lactic acid bacteria – LAB). Są one wykorzystywane do prowadzenia fermentacji jabłkowo-mlekowej (FJM, ang. malolactic fermentation – MLF) praktycznie we wszystkich winach czerwonych, niektórych winach białych oraz w winach bazowych do produkcji win musujących.

Zabieg ten ma za zadanie obniżenie kwasowości wina; zarówno miareczkowej jak i sensorycznej. FJM poprawia również stabilność mikrobiologiczną wina. Kwas L-jabłkowy, będący pożywką dla mikroorganizmów, zostaje na drodze enzymatycznej dekarboksylacji, przekształcony w kwas L-mlekowy z wydzieleniem CO₂*.

* Stąd zapewne pomysł, aby nazywać tę przemianę błędnie: fermentacją.
 
Bakterie kwasu mlekowego prowadzą fermentację (mlekową), w poprawnym tego słowa znaczeniu (o czym poniżej), ale nie dotyczy to konwersji kwasu L-jabłkowego do kwasu L-mlekowego.

Przy pewnych warunkach, bakterie te mogą wywoływać wysoce niepożądane zmiany smaku i/lub aromatu wina, w skrajnym przypadku czyniąc je niepijalnym. Wiele gatunków bakterii kwasu mlekowego nie prowadzi FJM (kwas L-jabłkowy → kwas L-mlekowy – jako jedyny izomer), a wzrost ich populacji może być dewastujący dla jakości wina.

Fermentacja jabłkowo-mlekowa może wystąpić spontanicznie w trakcie lub po fermentacji alkoholowej.

To właśnie spontaniczna FJM w wykonaniu niezidentyfikowanych bakterii kwasu mlekowego może prowadzić do nieprzewidywalnych i/lub niepożądanych rezultatów smakowo-aromatycznych w Twoim winie. Z uwagi na tę okoliczność zaleca się regularny monitoring wina pod mikroskopem, analizę organoleptyczną zapachu wina oraz rutynowe oznaczanie zawartości kwasu jabłkowego, octowego, a także D-mlekowego.

Skąd się biorą bakterie kwasu mlekowego?

Małe ilości BKM (<10³ jednostek tworzących kolonię / g) występują powszechnie na skórkach zdrowych winogron. Często są to właśnie te bakterie, które będą prowadzić naturalną (spontaniczną) FJM. Duże ilości „dzikich” BKM mogą rozwijać się na owocach uszkodzonych przez ptaki, osy i/lub choroby grzybowe. Po uszkodzeniu skórki, BKM obecne na winogronach mogą się łatwo rozmnażać, dzięki dostępowi do składników odżywczych z wnętrza jagody.

BKM mogą również rozwijać się w winiarni i często występują w/na beczkach i urządzeniach, które nie zostały odpowiednio zdezynfekowane, takich jak pompy, zawory i węże przesyłowe.

Rodzaje bakterii kwasu mlekowego

Bakterie kwasu mlekowego stanowią zróżnicowaną grupę mikroorganizmów, których wspólną cechą jest tworzenie (na drodze fermentacji mlekowej) kwasu mlekowego jako głównego produktu metabolizmu cukru:

C₆H₁₂O₆ (cukier) → 2 C₃H₆O₃ (kwas mlekowy) + 22,5 kcal.

BKM występujące w winie dzielą się na cztery rodzaje: Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus oraz Oenococcus, który jest najczęściej wykorzystywany do prowadzenia kontrolowanej FJM. Zastosowanie konkretnych szczepów bakterii (najczęściej Oenococcus oeni) w kulturach starterowych, zapobiega rozwojowi bakterii powodujących psucie się wina (głównie Lactobacillus i Pediococcus), które mogą wytwarzać duże ilości kwasu octowego i wpływać w ten sposób na obniżenie jakości wina (kwas octowy odpowiada za ponad 90% kwasowości lotnej).

Metabolizm bakterii kwasu mlekowego

Przyjrzyjmy się zatem bliżej preferencjom metabolicznym bakterii kwasu mlekowego. BKM można podzielić na heterofermentatywne i homofermentatywne, w zależności od sposobu w jaki fermentują one cukry (głównie glukozę). Różnica między nimi polega na tym, że te pierwsze fermentując cukier wytwarzają kwas mlekowy, octowy i etanol; natomiast te drugie wytwarzają z glukozy przede wszystkim kwas mlekowy.

Metabolizm Rodzaj / gatunek „Ulubiony” cukier Główne metabolity Kwas mlekowy¹
heterofermentatywne Lactobacillus
Leuconostoc
Oenococcus oeni
W. paramesenteroides
glukoza kwas mlekowy + CO₂ +
kwas octowy lub etanol²
D, L, DL
D
D
D
homofermentatywne Pediococcus glukoza kwas mlekowy (>85%³) L, DL
fakultatywnie
heterofermentatywne
P. pentosaceus
Lb. plantarum
glukoza (lub)
pentozy
kwas mlekowy
kwas mlekowy + kwas octowy
L, DL
D, L, DL

¹ Konfiguracja kwasu mlekowego wyprodukowanego z glukozy. DL oznacza mieszaninę (racemat) kwasów D- i L- mlekowego.
Obydwie formy są produkowane w małych ilościach (0,05-0,20 g/l) przez drożdże w trakcie fermentacji alkoholowej. Natomiast w trakcie fermentacji jabłkowo-mlekowej kwas L-mlekowy powstaje kiedy bakterie metabolizują kwas L-jabłkowy. Ilość powstałego kwasu L-mlekowego odpowiada 50% początkowej (na starcie FJM) zawartości kwasu L-jabłkowego i może osiągać nawet 3 g/l. Kwas D-mlekowy może występować w ilości 0,3 g/l i większej jako wynik degradacji cukrów resztkowych przez BKM.

² Teoretycznie z 1 mola glukozy bakterie heterofermentatywne wytwarzają po jednym molu kwasu mlekowego, CO₂ i kwasu octowego lub etanolu. W rzeczywistości bakterie te wytwarzają 0,8 mola kwasu mlekowego z glukozy. Produkcja kwasu octowego może wynikać z konwersji zarówno glukozy, jak i pentoz w warunkach nawet niewielkiej obecności tlenu. Natomiast w warunkach redukcyjnych komórki doświadczają niedoboru NAD⁺, a zatem acetylofosforan (ang. acetyl phosphate) jest przekształcany raczej w etanol niż kwas octowy. I odwrotnie, acetylofosforan może być wykorzystany do wytwarzania energii (ATP; w warunkach utleniających) do produkcji kwasu octowego, a co za tym idzie zwiększonej kwasowości lotnej wina.

³ Teoretycznie z 1 mola glukozy bakterie homofermentatywne powinny wytworzyć dwa mole kwasu mlekowego, jednak rzeczywista wydajność jest bliższa wartości 1,8 mola.

Z pośród wyżej wymienionych BKM, wszystkie Leuconostoc, wszystkie Lactobacillus (z wyjątkiem L. casei) oraz wszystkie Pediococcus przy poziomach pH wina wytwarzają kwas D-mlekowy z cukrów. Te same bakterie mogą również (za)hamować fermentację alkoholową*. Mogą też powodować rozwój niepożądanych smaków i aromatów, znanych jako skaza mleczna (ang. lactic taint, fr. piqûre lactique, wł. spunto lattico).

* Zarówno kwas octowy, jak i aldehyd octowy są toksyczne dla Saccharomyces cerevisiae i mogą prowadzić do zablokowania fermentacji alkoholowej.

Jak to się dzieje?

W trakcie wytłaczania winogron populacja bakterii jest mała, około 10³ do 10⁴ komórek/ml. Na tym etapie stwierdzono występowanie gatunków należących do rodzajów Lactobacillus, Pediococcus i Leuconostoc. W następnym etapie (fermentacja alkoholowa) populacja tych bakterii maleje. Może to wynikać z konkurencji drożdży oraz tworzenia etanolu i dwutlenku siarki przez drożdże podczas fermentacji alkoholowej.

Po fermentacji alkoholowej, bakterie które przeżyją rosną energicznie i rozpoczynają FJM. Populacja komórek może osiągnąć liczbę aż 10⁶ do 10⁸ komórek/ml. Zazwyczaj FJM prowadzą bakterie z gatunku Leuconostoc, ale w przypadku win o wysokim pH (3,5 i powyżej), gatunki Lactobacillus i Pediococcus mogą być zaangażowane.

Oenococcus oeni jest dość odporny na nieprzyjazne warunki występujące w winach tuż po zakończeniu fermentacji alkoholowej – znacznie bardziej niż pozostałe trzy rodzaje bakterii mlekowych, które czują się lepiej w nieco wyższym pH.

Wpływ pH na potencjalne ryzyko wystąpienia spontanicznej fermentacji jabłkowo-mlekowej

Zatem to głównie pH określa dominujący gatunek BKM w moszczu lub winie. Przy niskim pH (3,2 do 3,4) Oenococcus oeni jest najliczniejszym gatunkiem, podczas gdy przy wyższym pH (3,5 do 4,0) Lactobacillus i Pediococcus mogą przejąć kontrolę.

Po FJM los bakterii kwasu mlekowego zależy od składu wina i sposobu postępowania z winem. Jeśli pH wina jest wysokie (>3,5), a poziom SO₂ jest niewystarczający, wówczas szkodliwe gatunki BKM mogą rosnąć i zepsuć wino. Z tego też powodu szczególną uwagę należy zwrócić na wina podczas przechowywania po FJM.

Ponieważ bakterie kwasu mlekowego mogą się rozwijać w warunkach niskiej zawartości tlenu (są mikroaerofilne), mogą zatem rosnąć w całym winie, nawet jeżeli pojemnik jest wypełniony „pod korek”. Bakterie te mogą metabolizować cukry, kwasy oraz inne składniki wina wytwarzając przy tym kilka nowych związków (metabolity). Niektóre z nich stanowią o zepsuciu wina.

Bakterie kwasu mlekowego żywią się wszelkimi cukrami, które pozostają w winie po fermentacji alkoholowej (drożdże zostawiają niewielkie ilości cukrów niefermentujących) i rosną w liczbie. Bakterie te potrzebują mniej niż 1 gram na litr cukrów, aby stworzyć biomasę wystarczającą do przeprowadzenia FJM. Oczywiście oprócz degradacji cukrów są również w stanie przekształcić kwas jabłkowy w mlekowy, ale warto podkreślić, że jest to tylko jedna z ich aktywności metabolicznych.

Co jeszcze może pójść nie tak?

Przy pH 3,5 i powyżej, BKM chętniej metabolizują cukry, kwas cytrynowy, a nawet kwas winowy.

Wada Przyczyna Sprawcy
Kwasowość Wysokie poziomy kwasu octowego i kwasu mlekowego jako wynik metabolizmu cukrów. Lactobacillus
Pediococcus
Oenococcus
Diacetyl Diacetyl powstały w wyniku metabolizmu kwasu cytrynowego lub cukru nadaje winu „maślany” lub „przypominający serwatkę” smak, który może stać się nieprzyjemny przy wysokich stężeniach. Lactobacillus
Pediococcus
Akroleina Metabolizm glicerolu powoduje powstawanie akroleiny, która reagując z fenolami, tworzy kompleks, który nadaje winu gorzki smak. Lactobacillus
Pediococcus
Mannitol Mannitol, kwas octowy i kwas mlekowy mogą powstawać z wyniku redukcji fruktozy, nadając winu estrowo-octowy, lekko słodki smak. Głównie
Lactobacillus
Myszowatość Związki, które nadają winu posmak (właściwie wrażenie węchowe) przypominający aromat mysiej klatki, mogą powstawać na drodze metabolizmu aminokwasów występujących naturalnie w winogronach. Oenococcus
Lactobacillus
Śluzowatość Śluzowatość nadaje winu lepki/oleisty charakter, spowodowanym metabolizmem glukozy z wytworzeniem dekstranu (polisacharydu). Pediococcus
Geranium Jeżeli do wina dodano kwas sorbowy może on ulec redukcji do alkoholu sorbylowego, który reaguje z etanolem, tworząc 2-etoksy-3,5-heksadien. Związek ten ma silny zapach roztartych liści geranium (pelargonii). Oenococcus
Lactobacillus

Degradacja cukrów

Degradacja cukrów prowadzi do wyższych poziomów kwasowości lotnej w winie. Zatem kontrolowanie pH wina jest jednym z kluczy do zapobiegania zepsuciu wina przez BKM.

Wykorzystanie kwasu cytrynowego

Wykorzystanie kwasu cytrynowego i kwasu jabłkowego przez BKM może postępować jednocześnie, chociaż wykorzystanie kwasu cytrynowego przebiega znacznie wolniej. Zatem całkowita konwersja kwasu cytrynowego niekoniecznie pokryje się z końcem FJM, a poziom kwasu cytrynowego pozostającego w winie po FJM może okazać się wystarczający do wytworzenia przez bakterie zarówno kwasu octowego, jak i diacetylu.

Diacetyl i jego pochodne

Diacetyl i jego pochodne (acetoina i 2,3-butanodiol) są produktami ubocznymi metabolizmu kwasu cytrynowego.

Próg wyczuwalności diacetylu wynosi od 0,2 mg/L w winach z odmiany chardonnay, przez 0,9 mg/L dla win z odmiany pinot noir, po 2,8 mg/L w winach z odmiany cabernet sauvignon.

Diacetyl obecny w niewielkich stężeniach (1-3 mg/L) nadaje winu przyjemny zapach ciepłego masła (lub orzechów). Jednak w większych dawkach (powyżej 5-7 mg/L) odpowiada za mniej przyjemne tony, intensywnego maślanego aromatu, który może uchodzić za wadę wina. Odczuwanie „maślanego” aromatu nie zawsze da się przewidzieć na podstawie samego stężenia diacetylu, ze względu na różne matryce win.

Diacetyl · by Ben Mills - Own work, Public Domain, https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=3067696 Diacetyl · by Ben Mills - Own work, Public Domain, https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=3067696
Małą zawartość diacetylu można otrzymać szczepiąc BKM pod koniec fermentacji alkoholowej (kiedy populacja drożdży jest duża) i trzymać wino nad osadem (aby pozwolić drożdżom i BKM przekształcić diacetyl do acetoiny i dalej do bezzpachowego 2,3-butanodiolu o słodkim smaku).
 
Na obniżenie ilości diacetylu wpływa również dodatek SO₂, który wiąże (w sposób odwracalny) diacetyl. Dodanie SO₂ początkowo obniża stężenie diacetylu i zwiększa ilość związanego SO₂. Gdy po jakimś czasie kompleks diacetyl-SO₂ zdysocjuje („rozpadnie się”), poziomy diacetylu i wolnego SO₂ wzrosną.
Dla uzyskania wysokiej zawartości diacetylu, wino klaruje się / zlewa znad osadu (w celu zmniejszenia populacji drożdży) przed zaszczepieniem BKM oraz stabilizuje się wino od razu, kiedy tylko kwas jabłkowy zostanie zredukowany.
 
Najczęściej trzeba tu dokarmiać BKM ponieważ potrzebne im składniki odżywcze zostają usunięte na etapie klarowania.
 
Produkcję diacetylu promują również: obecność tlenu, niższe pH, duża zawartość kwasu cytrynowego i cukrów oraz temperatura poniżej 18°C.

 

W reakcji diacetylu z cysteiną (aminokwas zawierający siarkę) powstają tiazole,
które dają aromaty zrumienionego masła (popcornu), tostów, karmelu i orzechów laskowych.

Inne produkty uboczne

BKM mogą wytwarzać również akroleinę z glicerolu, która z kolei reaguje z grupami hydroksylowymi związków fenolowych, nadając winu nieprzyjemnej goryczy. Mogą powodować śluzowatość wina przez przekształcanie cukrów resztkowych w polisacharydy (np. glukany), które powodują wzrost lepkości wina. Wytwarzają nadmiar diacetylu, powodują powstawanie win „mysich” i wytwarzają karbaminian etylu z argininy. Mogą tworzyć aminy biogenne, takie jak histamina, tyramina i putrescyna, substancje o działaniu alergicznym. W pewnych warunkach BKM mogą metabolizować kwas sorbowy (konserwant; sorbinian potasu) i nadać winu zapach geranium.

Podsumowanie

Niekontrolowana aktywność bakterii kwasu mlekowego w winie może spowodować drastyczne pogorszenie jakości produktu końcowego. Bazowanie jedynie na spontanicznej FJM i ocena jej postępu orientacyjnie na podstawie zmian smaku wina, powoduje że winiarz nie kieruje tym procesem, a raczej stawia się w roli biernego obserwatora. Taki niekontrolowany proces jest ryzykowny i może spowodować dyskwalifikację wina na skutek nagromadzenia się w nim niekorzystnych metabolitów bakterii kwasu mlekowego.

Zmiany w smaku wina mogą być pożądane lub nie. I chociaż wino jest uważane za biologicznie stabilne po FJM, to nadal może w nim dochodzić do wzrostu drobnoustrojów powodujących jego psucie, takich jak bakterie kwasu mlekowego i bakterie kwasu octowego oraz różne niepożądane drożdże. Z tego też powodu rozważnym będzie dodanie siarczynów do wina tuż po FJM oraz wykazanie szczególnej troski o wino w trakcie jego przechowywania.

FJM w skrócie

Fermentacja jabłkowo-mlekowa

Źródło: The Unknown Winecaster (2018, 15 czerwca). Winecast: Malolactic Fermentation [Plik video]. Pobrane z: https://www.youtube.com/watch?v=Np-M3qjEg0w