Białka w winie pochodzą z dwóch źródeł: z winogron oraz z drożdży. Białka z drożdży (polipeptydy o niskiej masie cząsteczkowej oraz wysokocząsteczkowe mannoproteiny uwalniane podczas autolizy drożdży) nie przyczyniają się do powstawania zmętnień. Co więcej, pełnią one często rolę koloidów ochronnych, stabilizując matrycę wina i zapobiegając wytrącaniu się innych osadów.
Głównym czynnikiem odpowiedzialnym za niestabilność białkową w winach białych są białka pochodzące z winogron, które wykazują niezwykłą oporność na degradację w środowisku o niskim pH i wysokiej zawartości etanolu, dzięki czemu potrafią przetrwać proces fermentacji alkoholowej i dojrzewania wina.
Białka PR – główne czynniki mętności wina
Zdecydowana większość niestabilnych termicznie (termolabilnych) frakcji należy do rodziny białek związanych z patogenezą (Pathogenesis-Related proteins, w skrócie PR-proteins). Są to specyficzne enzymy i białka obronne syntetyzowane w komórkach rośliny w odpowiedzi na stres biotyczny (atak patogenów grzybowych, bakterii) lub stres abiotyczny (deficyt wody, rany mechaniczne, promieniowanie ultrafioletowe).
Wina zawierają dwie dominujące klasy białek z rodziny PR, które są bezpośrednio uwikłane w zmętnienia:
Chitynazy. Należą do klasy PR-3, a ich masa cząsteczkowa oscyluje w granicach od 25 do 32 kDa. Ich naturalną funkcją w roślinie jest degradacja chityny, będącej głównym strukturalnym składnikiem ścian komórkowych grzybów patogennych. Chitynazy posiadają strukturę bardziej eliptyczną i otwartą, przez co są znacznie mniej stabilne termicznie i bardziej wrażliwe na fluktuacje pH środowiska niż białka taumatynopodobne. Szereg badań dowodzi, że to właśnie frakcja chitynaz pełni rolę kluczowego inicjatora powstawania zmętnień aktywowanych czynnikami termicznymi w winach białych.
Białka taumatynopodobne (Thaumatin-Like Proteins, TLPs). Reprezentują one klasę PR-5 i charakteryzują się masą cząsteczkową od 20 do 25 kDa. Mają bardzo zwartą, globularną strukturę przestrzenną, która jest stabilizowana przez liczne, wewnętrzne mostki dwusiarczkowe. Z fizjologicznego punktu widzenia, ich zadaniem w roślinie jest niszczenie błon komórkowych patogenów. Ze względu na swoją budowę, białka te wykazują znaczną oporność na denaturację termiczną, a ich punkt izoelektryczny (pI) jest często wysoki (4,1-5,8). Oznacza to, że w typowym pH wina (3,0 – 3,6) cząsteczki te posiadają wyraźny ładunek dodatni.
O ile chitynazy częściej odpowiadają za widoczny osad, o tyle białka taumatynopodobne są głównymi sprawcami trwałych, opalizujących zmętnień, które są trudne do usunięcia bez zabiegów technologicznych.
Właściwość
Chitynazy (PR-3)
Białka taumatynopodobne (PR-5)
Główna rola biologiczna
Degradacja chityny patogenu
Hamowanie wzrostu strzępek grzybni
Masa cząsteczkowa (kDa)
25-32
20-25
Punkt izoelektryczny (pI)
4,1-5,8
4,1-5,8
Struktura drugorzędowa
Eliptyczna
Globularna (zwarta)
Wrażliwość termiczna
Wysoka (nieodwracalna)
Umiarkowana (częściowo odwracalna)
Odporność na pH wina
Wysoka
Bardzo wysoka
Podatność na bentonit
Dobra
Zróżnicowana (zależna od izoformy)
Oprócz wymienionych dwóch głównych klas, w moszczu identyfikuje się również mniejsze ilości innych białek roślinnych, takich jak inwertazy, białka przenoszące lipidy (Lipid Transfer Proteins, LTP), a także specyficzne białka związane bezpośrednio z procesem dojrzewania owoców (Grape Ripening-Related Proteins).
Odporność odmian hybrydowych a białka
Odporność odmian hybrydowych (PIWI) opiera się w głównej mierze na produkcji białek związanych z patogenezą (PR-proteins). Odmiany te zostały wyhodowane i wyselekcjonowane po to, aby potrafiły samodzielnie bronić się przed powszechnymi patogenami grzybowymi, takimi jak mączniak prawdziwy czy mączniak rzekomy.
Aby neutralizować zagrożenie, winorośl syntetyzuje enzymy (białka) zdolne do bezpośredniej degradacji struktur komórkowych grzybów. W przypadku winogron kluczową rolę odgrywają właśnie te dwie grupy:
Chitynazy (PR-3): Enzymy rozkładające chitynę, która jest podstawowym składnikiem strukturalnym ścian komórkowych większości grzybów.
Białka taumatynopodobne (TLP, PR-5): Enzymy, które zaburzają przepuszczalność i funkcjonowanie błon komórkowych patogenów, co skutecznie hamuje ich wzrost.
Akumulacja białek PR w jagodach u takich szczepów często następuje w sposób konstytutywny – oznacza to, że są one obecne na wysokim poziomie od samego początku, utrzymując roślinę „w gotowości” nawet w zupełnie zdrowych owocach. Dla porównania, w klasycznych odmianach Vitis vinifera produkcja tych białek gwałtownie wzrasta na ogół dopiero w odpowiedzi na trwającą infekcję, atak szkodników lub uszkodzenia mechaniczne.
Białka z grupy PR posiadają specyficzną, bardzo zwartą budowę przestrzenną (strukturę trzeciorzędową), która jest dodatkowo stabilizowana przez liczne mostki dwusiarczkowe. Ta ewolucyjna cecha sprawia, że są one wyjątkowo odporne na trudne środowisko: niskie pH soku, działanie naturalnych enzymów proteolitycznych (tnących białka) obecnych w owocach oraz biochemiczne warunki fermentacji alkoholowej.
W konsekwencji, niemal cała pula białek wytworzonych przez winorośl w celach obronnych przetrwa proces tłoczenia oraz winifikacji i w nienaruszonej formie trafi do gotowego wina.
Konsekwencje enologiczne
Ze względu na wysoką początkową zawartość białek obronnych, moszcze pozyskane z odmian hybrydowych charakteryzują się wyższym stężeniem białek rozpuszczalnych.
Oznacza to większe wyzwania związane ze stabilizacją białkową. Ponieważ chitynazy i białka taumatynopodobne to dokładnie te same frakcje, które powodują powstawanie zmętnień białkowych w winach białych i różowych pod wpływem zmian temperatury, wina z odmian odpornych wykazują wyższą niestabilność. Aby zapobiec wytrącaniu się osadów i uzyskać pełną stabilność cieplną, wina te wymagają zazwyczaj zastosowania wyższych dawek środków klarujących, w szczególności bentonitu.
Proces powstawania zmętnienia białkowego jest skomplikowanym zjawiskiem fizykochemicznym, które nie polega jedynie na prostym wytrąceniu substancji z roztworu. Jest to mechanizm wieloetapowy, który może zachodzić powoli na przestrzeni wielu miesięcy podczas magazynowania butelek w temperaturze pokojowej, lub gwałtownie, pod wpływem nagłego wystawienia wina na działanie podwyższonej temperatury.
Schemat procesu rozwijania i agregacji niestabilnych termicznie białek w winie
Gemini na podstawie: Matteo Marangon (2017, 31 października). New tools for white wine protein stabilization. Pobrane z: https://www.acenologia.com/new_tools_cienc1017/
Etapy powstawania osadu białkowego w winie
W pierwszym etapie tego procesu dochodzi do częściowej denaturacji białek PR. Cząsteczki białek w naturalnym środowisku wodno-alkoholowym wina przyjmują konformację, w której ich hydrofilowe fragmenty łańcucha peptydowego skierowane są na zewnątrz, oddziałując z rozpuszczalnikiem, podczas gdy regiony hydrofobowe ukryte są głęboko w rdzeniu struktury. Pod wpływem dostarczonej energii cieplnej lub powolnych zmian potencjału redoks, dochodzi do rozluźnienia struktury trzeciorzędowej. Następuje zjawisko rozfałdowania (ang. unfolding), w wyniku którego wcześniej ukryte, silnie hydrofobowe domeny białkowe zostają wyeksponowane na zewnątrz.
Drugi etap obejmuje zjawisko agregacji i flokulacji. Cząsteczki białek o odsłoniętych, hydrofobowych centrach wykazują termodynamiczną tendencję do łączenia się ze sobą w celu zminimalizowania niekorzystnego kontaktu z polarnym środowiskiem roztworu. Proces ten, prowadzący do powstawania początkowo niewidocznych gołym okiem mikroagregatów, jest silnie moderowany i katalizowany przez inne makromolekuły obecne w matrycy wina:
Co przyspiesza mętnienie wina? Rola polifenoli i siarczanów
Polifenole i związki garbnikowe. Monomery flawanoli oraz oligomeryczne procyjanidyny posiadają zdolność do sieciowania się z łańcuchami białkowymi, tworząc złożone kompleksy białko-polifenol. Związki te, ze względu na znaczny przyrost masy cząsteczkowej oraz zmniejszoną rozpuszczalność, inicjują proces koagulacji.
Jony siarczanowe (VI) oraz inne aniony nieorganiczne. Siarczany pełnią funkcję swoistych „pomostów” elektrostatycznych, które neutralizują resztkowe ładunki dodatnie na powierzchni mikroagregatów. Mechanizm ten przyspiesza transformację drobnych, rozpuszczalnych kompleksów białkowych w makroskopowe, gęste cząstki zmętnienia, które stają się widoczne dla ludzkiego oka (flokulacja).
Polisacharydy. Związki takie jak pektyny czy glukany mogą na różne sposoby wpływać na proces agregacji. W wielu przypadkach, zwiększając ogólną lepkość środowiska lub tworząc koloidy ochronne wokół cząstek białkowych, potrafią opóźnić lub rozproszyć wizualne pojawienie się zmętnienia. Należy jednak podkreślić, że nie zapobiegają one samej denaturacji białek, a w dłuższej perspektywie czasu mogą integrować się z polimerami białkowo-fenolowymi, wchodząc w skład wytrąconego, amorficznego osadu.
Jak zmniejszyć ryzyko niestabilności białkowej wina?
Zdrowsze owoce. Winorośl w odpowiedzi na uszkodzenia mechaniczne lub infekcje grzybowe (szczególnie szarą pleśnią – Botrytis cinerea) produkuje białka obronne. To właśnie ta grupa białek jest winiarskim utrapieniem – niezwykle dobrze znoszą one niskie pH moszczu i potrafią przetrwać cały proces fermentacji, by później nieoczekiwanie zmętnić wino w butelce. Zbierając i przetwarzając całkowicie zdrowe, nieuszkodzone winogrona, ograniczasz początkową pulę tych problematycznych białek.
Krótsza maceracja. Większość białek w winogronach jest zlokalizowana w komórkach skórek oraz tuż pod nimi. W przypadku produkcji win białych i różowych, im krótszy kontakt moszczu ze skórkami (maceracja), tym mniej białek przedostaje się do soku.
(W przypadku win czerwonych maceracja jest pożądana m.in. z powodu tanin. Taniny te wiążą się z białkami i naturalnie je wytrącają na dno zbiornika – dlatego wina czerwone praktycznie nie miewają problemów ze stabilnością białkową.)
Delikatniejsze tłoczenie. Agresywne lub wielokrotne wyciskanie w prasie prowadzi do fizycznego miażdżenia struktury skórek, co dosłownie „wypycha” z nich uwięzione białka do soku. Ponadto, mocne tłoczenie uwalnia większe ilości potasu z obszarów podskórnych, co podnosi pH moszczu, a wyższe pH również obniża stabilność wina. Prowadząc tłoczenie delikatnie, zyskujesz czystszy moszcz.
Jak zbadać stabilność białkową? Test cieplny wina
Praktyka enologiczna zakłada, że wino można uznać za stabilne fizykochemicznie, gdy w symulowanych, przyspieszonych warunkach stresowych różnica mętności przed i po teście nie przekracza określonego poziomu. Najczęściej stosowanym standardem analitycznym jest test cieplny (inkubacja przefiltrowanej próbki wina w temperaturze 80°C przez 30 do 120 minut, po której następuje jej kontrolowane schłodzenie).
Wino uznawane jest za bezpieczne do butelkowania, jeśli wzrost mętności, mierzony za pomocą profesjonalnego nefelometru, wynosi mniej niż 2 NTU (Nephelometric Turbidity Units).
Absolwent Metrologii Chemicznej na Wydziale Chemii Uniwersytetu Warszawskiego. Absolwent Wydziału Inżynierii i Technologii Chemicznej Politechniki Krakowskiej. Adiunkt w Instytucie Nauk o Jakości i Zarządzania Produktem UE w Krakowie.
Członek-założyciel Stowarzyszenia Winiarzy Jury Krakowskiej, członek zarządu Małopolskiego Stowarzyszenia Winiarzy. Wykładowca Podkarpackiej Akademii Wina w Jaśle. Operator sekatora w Winnicy Wesoła. Kurator danych i twórca Mapy Polskich Winnic. Entuzjasta win szczerych.
Jeśli moje kalkulatory i opracowania pomagają Ci w produkcji wina, w ramach rewanżu możesz postawić mi wirtualną kawę ☕. Dzięki temu zyskam więcej energii, żeby rozwijać ⚗️️ enolab.pl
